dilluns, 14 de desembre de 2015

Tesi doctoral de Valeria Rizzo 1 (3)


Portada de la tesi.    Foto: Agustí Meseguer

Introducció:

La Valeria Rizzo és una biòloga italiana, nascuda a Roma, que ha estat diversos anys a Barcelona completant els seus estudis fins a l’obtenció del doctorat. Va estudiar la llicenciatura a la universitat Sapienza Università di Roma, però per convenis entre les universitats de la Comunitat Europea va venir a Barcelona per fer la tesi doctoral.

La seva tesi està enfocada a l’estudi dels coleòpters subterranis troglobis del gènere Troglocharinus, un gènere endèmic de Catalunya i que és prou conegut per nosaltres per colonitzar les coves i avencs del Garraf, Montserrat i Sant Llorenç del Munt, per anomenar-ne els més propers i coneguts. Són comptadíssims els casos de tesis que tractin sobre fauna cavernícola, pel que considerem molt important la seva aportació per a la nostre biospeleologia.

La Valeria ha desenvolupat els estudis de la tesi a l’Institut de Biologia Evolutiva de Barcelona (CSIC – UPF), havent hagut d'iniciar-se i practicar l’espeleologia per poder accedir als pous i galeries que són l’hàbitat d’aquests petits escarabats. Durant uns anys hem col·laborat amb ella a través del Museu de Ciències Naturals de Barcelona, de la SIE de l’Àliga i del grup de l’Espeleo-dijous, preparant-la i iniciant-la en les tècniques de progressió vertical i tenint-la com a companya de sortides.

El 8 d’octubre d’enguany, a la Universitat Central, la Valeria va presentar la seva tesi al tribunal, sent-li concedida la qualificació Cum Laude. Vam demanar-li l’escrit que va llegir i ens la va fer arribar. Ella el va fer i llegir en castellà, cosa d’agrair per molts de nosaltres. Si bé es tracta d’un estudi altament especialitzat, també és important per a nosaltres, anar coneixent les tècniques i metodologies modernes que s’estan aplicant dins els estudis biològics, en què, cada vegada més, les clàssiques descripcions basades en la taxonomia es refermen amb els estudis genètics de l’ADN.

L'edició s'ha mantingut en la mateixa llengua que ella ho va escriure i llegit, havent-se dividit en tres parts degut a la seva considerable extensió i del gran nombre de diapositives (que són les que es van anar passant durant la lectura)

Ara ja us deixo amb la Valeria. Ja podem dir-la Dra. Rizzo!

Text de la seva lectura davant el tribunal:

Buenos días, os voy a presentar mi tesis doctoral hecha bajo la supervisión del Dr. Ignacio Ribera y de mi tutor, Dr. Carles Ribera, que trata de investigar la evolución, la diversificación y la ecología de un clado (cadascuna de les ramificacions de les línies evolutives d'una espècie determinada) de coleópteros estrictamente subterráneos.

Primeramente haremos una pequeña introducción sobre el medio subterráneo, la geomorfología de Catalunya y la historia de la bioespeleología. Luego os presentaré cada capítulo.

 General Introduction

Chapter 1

1.1 Early Pliocene range expansion of a clade of subterranean Pyrenean beetles

1.2 A new species of Troglocharinus Reitter, 1908 (Coleoptera, Leiodidae, Cholevinae, Leptodirini) from southern Catalonia, with a molecular phylogeny of the related species group.

Chapter 2

2.1 Lack of evolutionary adjustment to ambient temperature in highly specialized cave beetles

2.2 The fate of deep subterranean biodiversity under climate  change

Chapter 3

Substratum lithology determines dispersal and genetic structure in a strictly subterranean beetle (Troglocharinus ferreri, family Leiodidae)

Conclusions

En el capítulo 1, parte 1, analizamos la expansión y la diversificación de un género de coleópteros troglobios: el género Troglocharinus Reitter.

En la parte 2 del capítulo 1, os presentaré una nueva especie de ese género y su relación con el resto del género Troglocharinus.

En el segundo capítulo, testamos la tolerancia térmica y la capacidad de enfrentarse al cambio climático del género Troglocharinus y de un linaje completo de Leptodirini

En el tercer y último capítulo analizamos la influencia del substrato sobre la estructura poblacional de un complejo de especie del genero Troglocharinus.

Al final leeré las conclusiones.

El ambiente subterráneo:

El  medio subterráneo es uno de los ecosistemas más extendidos en el globo y sería todo lo que se encuentra por debajo de la superficie, en contraste con el epigeo, que se encuentra arriba.

El ambiente subterráneo se suele subdividir en endógeo (o edáfico, del suelo) y hipogeo (o subterráneo). Dentro del hipogeo hay el MSS y el medio subterráneo profundo.

    Evidentemente, la realidad es más compleja y no hay fronteras definidas entre ellos, y la importancia de los ecotonos (las fronteras entre diferentes ambientes) depende del tamaño del animal. Hay organismos de un tamaño muy inferior a la dimensión de la "frontera", que desarrollan toda su vida y se especializan en las transiciones entre hábitats, en las zonas que nosotros muchas veces no consideramos al hacer clasificaciones de este tipo. Para ellos la "frontera" sería su entorno permanente.

    Además el ambiente epigeo y el hipogeo están estrechamente  inter-relacionados, sobretodo por la elevada permeabilidad secundaria de las rocas presentes entre ellos, que dejan pasar todo tipo de perturbaciones, contaminantes o aportes tróficos y energéticos desde la superficie al ambiente subterráneo.
El ambiente hipogeo puede ser de origen natural, como las cavidades en capas carbonatadas (como lo que vemos en la imagen), volcánicas, tectónicas o artificiales, como las minas. Puede estar saturado de agua (la zona freática) por aguas meteóricas o  ríos subterráneos, o seco (zona vadosa); puede ser activo, o fósil.

De todas formas, todos los tipos de ambientes subterráneos tienen algo en común: oscuridad permanente, escasez de recursos energéticos y una temperatura prácticamente constante a lo largo del año.


El karst en Catalunya:


Catalunya tiene una diversidad geomorfológica muy marcada teniendo en cuenta su tamaño relativamente pequeño.

   Aquí podemos ver las tres grandes unidades morfoestructurales de Catalunya: los Pirineos, que se formaron por la deformación del sustrato cretácico autóctono durante el cenozoico, durante la orogénesis alpino-hymalaiana, y representan un corredor cárstico más o menos homogéneo.

    Luego está la depresión central, de material sedimentario evaporítico, o cuenca sedimentaria del Ebro, y la Serralada Litoral compuesta por sustrato metamórfico muy antiguo y sobre todo por macizos cársticos separados por ríos en sedimentos cuaternarios.

    Uno de estos es el Macizo del Garraf, compuesto por calcita y dolomía del Jurásico y del Cretácico principalmente.

La fauna subterránea:


La fauna cavernícola ha atraído la atención de los biólogos desde la descripción de los primeros troglobios en el siglo 19

Los biólogos se interesaron en los efectos que la ausencia de luz tiene en la vida de estos organismos, ausencia que es una barrera muy importante en la colonización de este ambiente.

Por eso los biólogos intentaron clasificar también los organismos que se encuentran en el ambiente subterráneo. Nosotros en toda esta disertación seguimos la terminología de Sket de 2008, y las que analizamos son especies  troglobias, o sea residentes obligadas y permanentes del ambiente subterráneo. En un nivel descendiente de dependencia del ambiente hipogeo estarían los eutroglófilos, los subtroglófilos, y por fin los trogloxenos, o sea, habitantes ocasionales.

Los productores primarios en el ambiente hipogeo pueden ser bacterias quemoautotrofas que utilizan material inorgánico/mineral como algunos sulfatos, que sustentan toda la sucesiva cadena trofica (Movile, Lechugilla etc). pero la mayoría de los recursos energéticos llegan de fuera (alóctonos).

    Entre los vertebrados los representantes con más especies son los peces y los anfibios, mientras que entre los invertebrados son los coleópteros. Hay 2.100 especies descritas de coleópteros cavernícolas pero en particular dos familias son muy numerosas: los carábidos y los leiódidos.
       Dentro de estas familias hay dos radiaciones monofiléticas importantes, los trechinos y los leptodirinos. Entre los ultimos, con 1800 especies, se encuentra nuestro género, que es parte de una única colonización miocénica de los Pireneos, que llevó a una radiación de más de 140 especies distribuidas a lo largo de esta cadena montañosa, que se puede definir como “Hot Spot” de diversidad para este grupo.

Antecedentes históricos:


Los primeros bioespeleólogos empezaron a discutir sobre la pérdida de órganos o rudimentación, un fenómeno muy común en los troglobios.

A causa de esta rudimentación, las especies cavernícolas fueron interpretadas como formas aberrantes de las especies Platónicas ideales, eso encajaba con la Filosofía Natural, y que la falta de uso llevaba a la desaparición de los órganos.

Resumiendo mucho toda la historia, empezó un debate  que ha llegado hasta hoy. Según biólogos como Agassiz, Packard, Lamarck, Racovitza, Jeannel, Vandel, los troglobios son ejemplos de “evolución regresiva” según una visión ortogenética en la cual la evolución tiene un fin que es la complejidad creciente, en la que el hombre está al final.
Darwin incluso, aunque eliminó la explicación de la  ortogénesis y la idea que la evolución tenía un fin, era ambiguo explicando la rudimentación, a veces con la selección, a veces con el desuso.

Sólo con la síntesi moderna, con Dobzahnsky, Mayr y gracias a las nuevas técnicas moleculares empezó a demostrarse que la pérdida y reducción de los caracteres, o troglomorfismo, tiene una base genética, pero también está influenciado por la plasticidad fenotípica, debido a la correlación entre la plasticidad comportamental y el oportunismo. También se vio que la rudimentación aparece también  en otros organismos, como los parásitos, sean animales o plantas.

El debate está abierto todavía, y la visión ortogenética, el concepto de regresión evolutiva o de ramas secas de la evolución está profundamente enraizado, y además, se conoce muy poco sobre esta fauna, quizás por su dificultad de acceso y de muestreo.


Debate sobre la fauna subterránea:


La visión tradicional de las especies subterráneas terrestres es que son ramas evolutivas sin salida, por lo general de reciente origen (en su mayoría Pleistocénico), que no se dispersan o diversifican una vez plenamente adaptados a las cuevas profundas o el suelo.

   Estas especies relictas antiguas, o fósiles vivientes, son vistas como sobrevivientes aislados de antiguos linajes extintos, no como el origen de radiaciones extendidas. Al contrario, se supone que, incluso para los taxones estrechamente relacionados, las especies subterráneas se originaron múltiples veces independientemente de ancestros epigeos no adaptado al ambiente de la cueva.

   Este múltiple origen se postuló independientemente de su modo de especiación, tanto si especiaron en aislamiento geográfico con los ancestros ​​de la superficie (es decir, la Climate Relict Hypothesis) o con flujo de genes parcial durante un tiempo limitado (la Adaptive Shift Hypothesis).

   Por lo tanto, para concluir, la posibilidad de que las especies terrestres subterráneas podrían ampliar sus áreas de distribución y diversificar una vez plenamente adaptado al medio subterráneo es raramente contemplada, y por lo general para las especies estrechamente relacionadas en una escala geográfica reducida.

   Recientemente, la aplicación de métodos moleculares ha permitido testar las hipótesis tradicionales sobre el origen y la distribución de la fauna subterráneas.

Tribu Letpodirini:


El género que se estudia pertenece a la tribu Leptodirini, que es una tribu de la familia Leiodidae.

Aunque se sabe que entre los Coleoptera hay múltiples ejemplos de grupos hipogeos, en particular en las familias Carabidae, Staphylinidae y Leiodidae, muchos de estos son una mezcla de especies hipogeas y epigeas, con diferentes grados de modificaciones morfológicas y especialización ecológica.

Pero la tribu Leptodirini parece representar una extensa radiación monofilética de especies exclusivamente subterráneas.

Esta tribu incluye en la actualidad 1.800 especies,  y la mayor diversidad se encuentra en la cuenca del Mediterráneo.

El género Troglocharinus se encuentra anidado dentro de la serie filética pirenaica Speonomus, y tiene una distribución discontinua, con un clado en la zona costera de Barcelona.


Género Troglocharinus:


A la derecha de la diapositiva anterior, vemos el filograma de los Leptodirini de los Pirineos, con topología basada en la probabilidad bayesiana.

Podemos ver la posición del género Troglocharinus en el grupo Speonomus, que se separó del resto de Leptodirini hace 33 millones de años (en adelante, MY).

A partir de nodo 8, el clado incluye solamente especies con una fuerte adaptación al medio subterráneo, o sea son ápteros, ciegos, despigmentados y con modificación metabólica.

Troglocharinus se originó alrededor de 10 MY.

Tiene 19 especies y 19 subespécies, como hemos dicho tiene una distribución disjunta, lo que es muy raro entre los organismos subterráneos, y está muy adaptado a la vida subterránea.

Capítulo 1:

Este capítulo trata la “Early Pliocene range expansion of a clade of subterranean Pyrenean beetles”




Objetivos:


Los objetivos de este apartado son investigar el origen filogenético y geográfico de las especies de Troglocharinus, y la posibilidad de una expansión de rango.

Luego, estimar una estructura temporal para la divergencia de los linajes principales dentro del género, y explorar posibles escenarios para su expansión.


Métodos:


Se han estudiado 50 ejemplares de los dos clados geográficos.

Los ejemplares se recogieron en las cuevas con el uso de cebos o en su mayoría directamente con aspiradores.

Se obtuvieron las secuencias de cinco genes mitocondriales y dos genes nucleares.    Para alinear los fragmentos de genes se utilizó MAFFT con los algoritmos adecuados a cada tipo de gen.

Utilizamos dos enfoques estadísticos para reconstruir la filogenia del género: las probabilidades  bayesianas y la máxima verosimilitud.

 Los análisis bayesianos del conjunto de datos se llevaron a cabo en una matriz de datos combinada con MrBayes 3.1.2 (Huelsenbeck y Ronquist, 2001), utilizando dos esquemas de partición: 1) seis particiones correspondientes a los seis genes secuenciados y 2) una partición por la posición del codón(el codón es una secuencia de tres nucleótidos de ADN o ARN que se corresponde con un aminoácido específico o señal de parada durante la síntesis de proteínas).

El modelo evolutivo de cada partición se estimó antes del análisis con jModelTest utilizando el Criterio de Información de Akaike (AIC)

 Se realizaron búsquedas de máxima verosimilitud en la versión paralela de RAxML, con un modelo GTR + I + G y la misma partición por genes utilizada en MrBayes.


Métodos:

Para obtener un árbol ultramétrico calibrado utilizamos inferencia bayesiana en Beast
se utilizó una tasa a priori estimada en Ribera et al. (2010) para la misma combinación de genes mitocondriales y el mismo grupo de escarabajos, calibrado con la separación tectónica de la placa Corso-Sarda.

Se utilizó un reloj molecular relajado (con distribución lognormal no correlacionado), que permite la variación en las tasas de sustitución entre las ramas.

Se estimó la tasa de diversificación mediante el log-lineage through time(LTT), utilizando el árbol ultramétrico obtenido en Beast.

Se utilizó el estadístico gamma para medir el tiempo relativo de diversificación, es decir, si gamma es menor de cero, los nodos internos están más cerca de su raíz de lo esperado en un proceso de pure birth, y viceversa.

 Entonces se construyó un cladograma basado en el árbol ultramétrico obtenido en BEAST pero incluyendo las especies que faltaban en la posición más probable de acuerdo a la similitud morfológica de los genitales masculinos y su distribución geográfica, y se simularon las posibles topologías con Mezquite.

Todas las pruebas de diversificación se realizaron utilizando las bibliotecas R 'ape' y 'láser'.

 Se reconstruyeron las zonas ancestrales de distribución con Lagrange, un método de inferencia basado en el modelo que tiene en cuenta las longitudes de rama y una matriz a-priori de probabilidades de dispersión entre las áreas reconocidas.


RESULTADOS

Filogenia:

Las topologías de los árboles obtenidos con los dos esquemas de partición de las probabilidades bayesianas (por los genes y por codón) y los obtenidos con máxima verosimilitud en RAxML son casi idénticos.  

   Solamente difieren en la posición dentro del mismo clado de dos especímenes de T. Ferreri y uno T. elongatus mateui. Las dos particiones de MrBayes resultan en topologías idénticas, aunque la partición por codón tenía un Soporte en general inferior.
Todos los resultados apoyan fuertemente la monofilia del género Troglocharinus, que es hermana de un clado formado por parte de los géneros pirenaicos centrales.

    Las especies en las dos áreas geográficas de distribución de Troglocharinus son respectivamente monofiléticas, con un fuerte soporte para el clado de los Pirineos, y un soporte sólo moderado para el clado costero en los análisis combinados.

    Dentro de cada uno de los dos linajes de Troglocharinus había clados bien soportados, con profundas divergencias dentro de algunas de las especies, y parafilia generalizada.



Filogenia:

Dentro del grupo costero hay 4 clados distribuidos en diferentes macizos montañosos, separados por ríos en sedimentos cuaternarios
La primera división separa las especies T. ferreri, distribuida en el macizo del Garraf cerca de Barcelona, aislado por el río Llobregat en el noreste, el río Anoia, en el norte, y el río Foix en el suroeste.

En algunos casos, estos clados representan subespecies (como T. kiesenwetteri), pero en otros no había una clara correspondencia entre la taxonomía actual del grupo y los linajes filogenéticos (por ejemplo T. elongatus, T. fonti).

El clado pirenaico se distribuye en una zona geológicamente más continua, con la deformación alpina de un sustrato Cretácico sin grandes discontinuidades debidas a las cuencas sedimentarias del Cuaternario. Esto se refleja en la falta de una distribución geográfica clara de los clados, aunque el gran número de especies que faltan en este grupo podría oscurecer algunos patrones

Divergencia y área ancestral:

Mapa ampliat de l'anterior diapositiva, per poder veure els comentaris del text

El clado de T. kiesenwetteri y T. patracoi incluye todas las especies que viven al norte de los ríos Llobregat y Anoia, con la inclusión del macizo de Montserrat (área K diapo. anterior)

El clado de T. elongatus, T. orcinus y otros se distribuye a lo largo de un karst continuo de origen Triásico - Pérmico al suroeste de los ríos Anoia y Foix, y al norte del río Francolí (zona E). La única especie del subgénero Antrocharidius, T. (A.) orcinus (con cuatro subespécies), está anidada en el profundo de este clado, que ocupa la zona suroeste extrema, y ​​separada del resto por el río Francolí (área  A).

Beast (programa para datar los tiempos de divergencia):

La edad estimada del linaje stem de Troglocharinus es 10 MY, muy similar a la estimada en Ribera et al. (2.010), con un intervalo de confianza amplio (como es habitual en este tipo de análisis).

Hubo un intervalo de 6 MY entre el origen del género y el último ancestro común de todas las especies incluidas en la muestra, ancestro que se estima ca. 4 MY al comienzo del Plioceno.

Los tres clados principales dentro del linaje costero diversificaron al final del Plioceno (el complejo T. ferreri en el macizo del Garraf) o principios del Pleistoceno (los clados separados por el río Anoia), de acuerdo con las fechas estimadas para la formación de las cuencas sedimentarias. La mayoría de los taxones actuales se originaron durante el Pleistoceno, tanto en la costa y la zona pirenaica.

Área Ancestral:

El origen geográfico del género Troglocharinus (El nodo 1 en la diapositiva anterior) se estimó en la región de los Pirineos (P) con una alta probabilidad (ca. 0,90 para todos los escenarios).

Las otras posibilidades eran o el macizo del Garraf (F) o el área de distribución de T. kiesenwetteri y especies afines (K), siempre con bajas probabilidades.

 La secuencia de colonización de la zona costera (nodo 2) no pudo ser establecida con precisión, aunque los resultados en general favorecieron un origen en el macizo del Garraf, al sur de Barcelona, ​​a pesar de estar geográficamente más distantes de los Pirineos que la zona de distribución de T. kiesenwetteri.

Diversificación:

Para el análisis de la diversificación usamos todo el género y los dos linajes que corresponden a las dos áreas geográficas, para poner a prueba las posibles diferencias en los patrones de diversificación entre ellos.
El clado costero dio resultados similares a los de todo el género, con una γ significativamente negativa, y un modelo de diversificación con un cambio de tasa como óptimo.
El clado pirenaico, por el contrario, tenía una γ no significativamente diferente de cero, y un modelo continuo, con una sola tasa de diversificación, como modelo óptimo (gráficos de diapositiva anterior).

Estas diferencias pueden reflejarse en el contraste observado en los patrones de diversificación: mientras que el clado costero muestra una disminución de la tasa de diversificación con el tiempo (con una gama significativamente negativa), lo que sugiere una saturación del espacio disponible debido al aislamiento de los pequeños áreas, no hay ninguna señal de saturación en el clado de los Pirineos, con una gama no significativa y una tasa de especiación constante como el modelo preferido.

Discusión:

Se ha demostrado que especies en principio totalmente adaptadas al medio subterráneo (totalmente troglobias), si se dan las condiciones adecuadas pueden desplazarse y expandir el rango a zonas que están aisladas, lo que implica que por lo menos pueden hacer desplazamientos cortos por superficie. Pero las condiciones adecuadas no se deben dar muy a menudo ni duran mucho: el único caso demostrado es el de Troglocharinus, de modo que en los más de 20 MY de historia del clado de los pirineos solo una vez una especie expandió el rango para colonizar un ambiente cárstico aislado.
También se ha demostrado que una vez colonizada la costa, con la llegada del clima mediterráneo muy seco y con estaciones marcadas, estos desplazamientos por superficie ya no fueron posible y el clado se vio confinado al medio subterráneo.

Final de la 1ª part

Autora de l'escrit i de les diapositives: Dra. Valeria Rizzo

...segueix en l'apunt de demà...

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